DNA เวกเตอร์ทางพันธุกรรมส่วนของDNAที่มีไว้สำหรับการโคลนโมเลกุลจะต้องสามารถทำซ้ำได้ เมื่อมันถูกถ่ายโอนไปยังเซลล์แบคทีเรีย กล่าวคือเป็นแบบจำลอง อย่างไรก็ตาม เขาไม่มีความสามารถนี้ ดังนั้น เพื่อให้แน่ใจว่าการถ่ายโอนและการตรวจหายีนโคลนนิ่งในเซลล์ พวกมันจะถูกรวมเข้ากับเวกเตอร์พันธุกรรมที่เรียกว่า หลังต้องมีอย่างน้อย 2 คุณสมบัติ ขั้นแรกเวกเตอร์ต้องสามารถทำซ้ำได้ในเซลล์และที่ปลายหลายด้าน

ประการที่สองควรอนุญาตให้มีการเลือกเซลล์ที่มีเวกเตอร์ เช่น มีเครื่องหมายซึ่งเป็นไปได้ที่จะตอบโต้การเลือกเซลล์ ที่มีเวกเตอร์ร่วมกับยีนโคลน โมเลกุลDNAรีคอมบิแนนท์ พลาสมิดและฟาจตรงตามข้อกำหนดเหล่านี้ พลาสมิดเป็นพาหะนำโรคที่ดีเพราะพวกมันเป็นเรพลิคอน และอาจมียีนสำหรับการดื้อต่อยาปฏิชีวนะใดๆ ซึ่งช่วยให้สามารถเลือกแบคทีเรีย สำหรับการดื้อต่อยาปฏิชีวนะนี้ ดังนั้น จึงตรวจพบโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมได้ง่าย

เนื่องจากไม่มีพลาสมิดเวกเตอร์ตามธรรมชาติ พลาสมิดเวกเตอร์ทั้งหมดที่รู้จักจนถึงขณะนี้จึงถูกสร้างขึ้นเทียม ทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นสำหรับการสร้างเวกเตอร์ ทางพันธุกรรมจำนวนหนึ่ง ซึ่งลำดับDNAที่มากเกินไป รวมถึงที่มีตำแหน่งการจำกัดหลายตำแหน่ง ถูกกำจัดออกด้วยความช่วยเหลือของการจำกัด การกำจัดนี้ถูกกำหนดโดยข้อเท็จจริงที่ว่าพลาสมิดเวกเตอร์ ควรมีตำแหน่งการจดจำเพียงตำแหน่งเดียว สำหรับเอนไซม์การจำกัดหนึ่งตำแหน่ง

รวมถึงไซต์นี้ควรอยู่ในบริเวณที่ไม่สำคัญ ตามหน้าที่ของจีโนมพลาสมิด ตัวอย่างเช่น พลาสมิดเวกเตอร์ pBR 322 ซึ่งมียีนต้านทานแอมพิซิลลิน และเตตราไซคลินทำให้สะดวกมาก สำหรับการเลือกแบคทีเรียที่มีเซ็กเมนต์ DNAที่ลอกแบบมานั้น มีไซต์จำกัดเพียงจุดเดียวสำหรับเอนไซม์จำกัดมากกว่า 20 ตัว รวมถึงเอนไซม์การจำกัดที่รู้จักกันดี เช่น Eco RI,Pst I,Pva II ฟาจเวคเตอร์มีข้อดีหลายประการเช่นกัน พวกมันอาจรวมถึงชิ้นส่วน DNAที่ลอกแบบได้ที่มีขนาดใหญ่กว่า

เมื่อเปรียบเทียบกับเวกเตอร์ในพลาสมา นอกจากนี้ การถ่ายโอนชิ้นส่วนที่โคลนโดยฟาจไปยังเซลล์ อันเป็นผลมาจากการติดเชื้อของส่วนหลังนั้นมีประสิทธิภาพมากกว่าการเปลี่ยนแปลงของดีเอ็นเอ ในที่สุดฟาจเวคเตอร์ยอมให้มีการตรวจคัดกรอง ที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นบนพื้นผิววุ้นของโคโลนีที่มีเซลล์ ซึ่งพายีนที่โคลนนิ่งฟาจเวคเตอร์จำนวนมากอาศัยแลมบ์ดาฟาจ นอกจากฟาจแล้วไวรัสเวคเตอร์อื่นๆ ที่สร้างจากไวรัสเริม เช่นเดียวกับพาหะที่สร้างจากDNAของยีสต์

ซึ่งถูกนำมาใช้เช่นกัน หากการโคลนยีนทำได้โดยใช้สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหรือเซลล์พืช ข้อกำหนดสำหรับพาหะจะเหมือนกับในกรณี ของการโคลนนิ่งในเซลล์แบคทีเรีย การสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสม การสร้างโดยตรงของโมเลกุล DNA รีคอมบิแนนท์ จะตามมาหลังจากที่ได้รับข้อจำกัดของDNAที่ศึกษาและDNAเวกเตอร์แล้ว ประกอบด้วยการปิดส่วนการจำกัดของDNAที่ศึกษาโดยมีการจำกัดDNAของเวกเตอร์ ซึ่งเป็นผลมาจากข้อจำกัด

ถูกเปลี่ยนจากDNAแบบวงกลมไปเป็นเส้นตรง ในการปิดชิ้นส่วนของDNAภายใต้การศึกษาด้วยเวกเตอร์DNAนั้นจะใช้DNAการผูกจะประสบความสำเร็จ หากโครงสร้างที่จะต่อเชื่อมมีหมู่ 3ไฮดรอกซิลและฟอสเฟต และหากกลุ่มเหล่านี้ถูกจัดเรียงในลักษณะที่เหมาะสมซึ่งสัมพันธ์กัน ชิ้นส่วนต่างๆ จะรวมกันผ่านปลายที่เหนียวซึ่งเป็นผลมาจากการเติม ที่เศษส่วนที่มีความเข้มข้นสูง ชิ้นส่วนหลังจะกลายเป็นตำแหน่งที่ถูกต้องเป็นครั้งคราว

ข้อจำกัดหลายอย่าง เช่น RI ทำให้เกิดปลายเหนียวสี่ฐาน กระบวนการผูกมัดที่ปลายเหนียวซึ่งประกอบด้วยสี่ฐาน เกิดขึ้นที่อุณหภูมิต่ำหากชิ้นส่วนที่ไม่มีปลายเหนียวก่อตัวขึ้นในระหว่างการจำกัด พวกมันจะถูกแปลงอย่างบังคับ เป็นโมเลกุลที่มีปลายที่เหนียวโดยใช้เอนไซม์ทรานสเฟอร์เอส เอนไซม์นี้เพิ่มนิวคลีโอไทด์ไปที่ส่วนท้าย 3 ของDNAในชิ้นส่วนหนึ่ง อาจเพิ่มหางโพลีเออีกชิ้นหนึ่งเป็นหางโพลีที ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส PCR

เพื่อสร้างปลายDNAที่ต้องการอีกด้วยหลักการของ PCR นั้นอิงจากการเสื่อมสภาพของDNAที่แยกได้จากเซลล์และการหลอมของมันด้วยการเพิ่มDNAโอลิโกนิวคลีโอไทด์ซึ่งแต่ละอันประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 15 ถึง 20 ตัวไปยังสายโซ่ที่ปรับสภาพใหม่ โอลิโกนิวคลีโอไทด์เหล่านี้ ซึ่งต้องประกอบกับลำดับในเกลียวที่ คั่นด้วยนิวคลีโอไทด์ 50 ถึง 2000 เป็นเมล็ดพันธุ์สำหรับการสังเคราะห์DNAในหลอดทดลองพวกมันยอมให้DNAพอลิเมอเรส

คัดลอกบริเวณที่อยู่ระหว่างเมล็ดพืช การคัดลอกนี้ให้สำเนาชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ศึกษาเป็นจำนวนมาก การนำโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมเข้าสู่เซลล์ หลังจากที่ชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ที่น่าสนใจถูกหลอมรวมกับเวกเตอร์ทางพันธุกรรมโดยใช้DNAลิกาเซ โมเลกุลลูกผสมที่เป็นผลลัพธ์ จะถูกนำเข้าสู่เซลล์เพื่อให้เกิดการจำลองแบบ เนื่องจากเวกเตอร์ทางพันธุกรรมและเพิ่มจำนวนสำเนา วิธีที่นิยมมากที่สุดในการแนะนำโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมเข้าไปในเซลล์

โดยที่เวกเตอร์คือพลาสมิด คือการเปลี่ยนแปลงของอีโคไล เพื่อจุดประสงค์นี้เซลล์แบคทีเรียจะได้รับการบำบัดล่วงหน้า ด้วยแคลเซียมหรือรูบิเดียม เพื่อที่จะให้พวกเขากลายเป็นความสามารถ ในการรับรู้ถึงดีเอ็นเอลูกผสม เพื่อเพิ่มความถี่ของการเจาะดีเอ็นเอเข้าไปในเซลล์ ใช้วิธีอิเล็กโตรโพเรชัน ซึ่งประกอบด้วยการเปิดเผยเซลล์ในช่วงเวลาสั้นๆ สู่สนามไฟฟ้าที่รุนแรง การรักษานี้จะสร้างโพรงในเยื่อหุ้มเซลล์ ซึ่งทำให้เซลล์รับDNAได้ง่ายขึ้น

หลังจากที่นำโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมเข้าสู่แบคทีเรียแล้ว โมเลกุลหลังจะถูกหว่านบน MPA ที่เสริมด้วยยาปฏิชีวนะเพื่อเลือกเซลล์ที่ต้องการ กล่าวคือเซลล์ที่มีโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสม ความถี่ของการเปลี่ยนแปลงต่ำ โดยปกติหนึ่งการแปลงจะเกิดขึ้นทุกๆ 105 เซลล์เมล็ด ถ้าเวกเตอร์เป็นฟาจ การทรานส์เฟกชันของเซลล์ แบคทีเรียหรือยีสต์ด้วยฟาจจะถูกนำมาใช้ สำหรับโซมาติกเซลล์ของสัตว์นั้น พวกมันจะถูกทรานส์เฟกด้วยDNAในที่ที่มีสารเคมีที่เอื้อต่อการเคลื่อนผ่านDNAผ่านเยื่อหุ้มพลาสมา การฉีดDNAแบบไมโครโดยตรงไปยังเซลล์ไข่ เซลล์โซมาติกที่เพาะเลี้ยง และตัวอ่อนของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมก็สามารถทำได้เช่นกัน

บทความอื่นๆที่น่าสนใจ : เซลล์ สารเซลลูลาร์ที่ซับซ้อน และองค์ประกอบทางเคมี